ИННОВАЦИОННЫЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ЦЕНТР МОСКОВСКОЙ ВЕТЕРИНАРНОЙ АКАДЕМИИ ИМ. К.И. СКРЯБИНА

Исследование влияния сверхмалых доз аллергена на базофилы

Бобровский М.А. -  Ветеринарный врач ИВЦ МВА, аспирант кафедры ветеринарной хирургии МГАВМиБ им.К.И.Скрябина.

Ветер Д.С. - Ветеринарный врач ИВЦ МВА, соискатель кафедры ветеринарной хирургии МГАВМиБ им.К.И.Скрябина.

 

Введение

В последние годы, в ветеринарной медицине, широкое распространение среди практикующих ветеринарных врачей, получило применение гомеопатических препаратов, в качестве лечения многих хронических, онкологических, а так же многих других менее серьезных патологий. Параллельно были получены данные о положительном результате в лечении домашних животных, препаратами,  содержащих сверхмалые дозы действующего вещества.

В результате мы, с одной стороны получили огромный потенциал для развития ветеринарной медицины в целом, и с другой стороны ряд нерешенных проблем. В частности ни среди практикующих ветеринарных врачей, не среди ветеринарных гомеопатов, нет единого мнения о механизмах действия гомеопатических препаратов. Некоторые специалисты утверждают, что в основе данного явления лежат механизмы физико-химического и энергетического изменения структуры растворителя – воды, при отсутствии первоначально растворенного вещества, путем многократного растворения. Другие же специалисты, утверждают, что гомеопатия действует исключительно в небольших концентрациях растворенного вещества, оказывающего стимулирующий эффект на организм животного.  В первом случае, речь идет о так называемых «мнимых растворах». Во втором, мы говорим о биологических эффектах сверхмалых доз вещества.

В данной статье, мы исследуем действие сверхмалых доз вещества, на чувствительные структуры организма. В частности – влияние гомеопатических доз аллергена на базофилы.

В организме животных, ряд биологически активных веществ, находятся малых и сверхмалых концентрациях. Так известный гормон адреналин, содержится в концентрации 1,9 * 10-9М, норадреналин 5,2*10-9М, а также адгезин 10-15 – 10-10М – способный стимулировать пролиферацию фибробластов. Но многие гомеопатические препараты, разводятся до концентраций, при которых в исходном растворе, от первоначального вещества не остается, ни одной молекулы исходного вещества. Так разведение 1 моля «чистого» препарата до концентрации 1 : 6,022×1023 (по классификации гомеопатов 11,89С, 23,78D или 23,78X — округления степеней до сотых долей) будет содержать только одну молекулу исходного вещества. Таким образом, вероятность того, что 1 моль разведения 13C содержит хотя бы одну молекулу исходного вещества, равна 1 %.

В нашем исследовании, мы разводили аллерген до концентрации 12С и исследовали реакцию базофилов на данное воздействие.

Базофилы - очень крупные гранулоциты: они крупнее и нейтрофилов, и эозинофилов. Гранулы базофилов содержат большое количество гистамина, серотонина, лейкотриенов, простагландинов и других медиаторов аллергии и воспаления. Базофилы принимают активное участие в развитии аллергических реакций немедленного типа. Попадая в ткани, базофилы превращаются в тучные клетки, содержащие большое количество гистамина — биологически активного вещества, которое стимулирует развитие аллергии.

Экспремнентальная часть

Из истории болезни: Собака "Джек", метис, самец, 1,5лет, вес 20кг. Особенности лечения - имеется аллергическая реакция на цефазолин, цефатаксим, цефтриаксон.

В качестве исследуемого материала, в две стерильных пробирки, содержащих ЭДТА, были взяты пробы крови. До исследования, пробы хранились в течение 12 часов, при температуре 25°С. По истечению данного периода, пробы были доставлены в лабораторию для исследования активности базофилов, методом проточной цитометрии.

Как было отмечено из истории болезни, у животного наблюдается аллергия на цефазолин, поэтому в качестве аллергена, был выбран данный препарат.

Цефазолин - цефалоспориновый антибиотик I поколения для парентерального применения. Действует бактерицидно, нарушая синтез клеточной стенки микроорганизмов. Имеет широкий спектр действия, активен в отношении грамположительных (Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus (не продуцирующие и продуцирующие пенициллиназу; в т.ч. Streptococcus pneumoniae), Corynebacterium diphtheriae, Bacillus anthracis) и грамотрицательных (Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Treponema spp., Leptospira spp.) микроорганизмов. Активен в отношении Haemophilus influenzae, некоторых штаммов Enterobacter и Enterococcus. Неэффективен в отношении Pseudomonas aeruginosa, индолположительных штаммов Proteus spp., Mycobacterium tuberculosis, Serratia spp., анаэробных микроорганизмов, метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus spp.

В сенсибилизированном организме антитела IgE-типа фиксируются на тучных клетках и базофилах. При связывании аллергена с соответствующими антителами в клетке запускается каскад реакций, в результате которых наступает активация клеток, разрушается комплекс актин-миозин, гранулы сливаются с мембраной клетки и их содержимое выбрасывается наружу. Вещества, освобождающиеся в результате дегрануляции (гистамин, протеиназы, ферменты и др.), вызывают развитие воспалительной реакции и приводят формированию клинических признаков аллергии.

В результате встраивания мембраны гранул в поверхностную мембрану клетки при дегрануляции, на поверхности базофилов появляются дополнительные молекулы, называемые маркерами дегрануляции (CD63), а также повышается экспрессия поверхностных активационных молекул (CD203c). Добавление аллергена к клеткам крови в условиях in vitro имитирует процессы, происходящие в сенсибилизированном организме, и у нас имеется возможность зарегистрировать экспрессию маркеров дегрануляции или активации на базофилах с помощью проточной цитофлуориметрии.

Для исследования, в данной работе, был применен набор для определения клеточной чувствительности к аллергенам - Allergenicity Kit. Allergenicity Kit состоит из трехцветной комбинации моноклональных антител, активирующего раствора, положительного контроля для IgE-опосредованной активации базофилов, стоп- раствора и лизирующего и фиксирующего агентов. Набор предназначен для исследований in vitro на образцах цельной крови для оценки активированных базофилов. Реагенты данного набора служат для идентификации покоящихся и активированных базофилов с помощью проточной цитометрии. Для этого используется трехцветная комбинация антител. Она представляет собой смесь двуцветного реагента CD203c-PE/CD3-PC7 и одноцветных крысиных моноклональных антител CRTH2-FITC.

CD203c

Базофилы и тучные клетки – гемопоэтические эффекторные клетки, вовлеченные в аллергическую и воспалительную реакции. Оба типа клеток экспрессируют рецептор IgE (FcεR1).

Моноклональные антитела 97А6 распознают поверхностный антиген, экспрессирующийся только на базофилах периферической крови, на других клетках этот маркер не обнаружен. Также, антитела взаимодействуют с зрелыми тучными клетками и CD34-позитивными предшественниками базофилов и тучных клеток. Более того, экспрессия CD203c значительно повышается после активации базофилов антителами к IgE или различными аллергенами. Маркер активации базофилов, детектируемый антителами 97А6, идентичен экто-нуклеотидной пирофосфатазе/фосфодиэстеразе 3 (E-NPP3), которая является трансмембранным белком II типа и принадлежит семейству эктоэнзимов, участвующих в гидролизе внеклеточных нуклеотидов.

В первом опыте, мы развели аллерген до гомеопатической концентрации 12С. В лаборатории, клетки изучаемого материала были окрашены моноклональными антителами в присутствии аллергена.Затем был произведен лизис эритроцитов смесью «Fix-and-Lyse», и проведен анализ в проточном цитометре. Базофилы были выделены по экспрессии CRTH2 и CD203c, предварительно исключив Т- лимфоциты (CD3+ клетки). Не активированные и покоящиеся базофилы имеют фенотип CRTH2 posCD203cdimCD3neg (CRTH2 – позитивные, CD203c – слабая экспрессия, CD3 – негативные). В то время как активированные базофилы in vitro определяют как CRTH2posCD203cbrightCD3neg клетки (CD203c – яркая экспрессия).

Проточный цитометр анализирует светорассеяние и флуоресценцию клеток. В частности фиксируется:  рассеяние света под малыми углами (от 1°до 10°) (данная характеристика  используется для определения размеров клеток); рассеяние света под углом 90°(позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток); интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др. Выделенные клетки анализируют, разделяя позитивные и негативные события. Анализ антигена CD203c позволяет охарактеризовать покоящиеся и активированные базофилы при IgE- независимом ответе у сенсибилизированного пациента.

В первом же опыте, по оценке активности базофилов в присутствии аллергена – цефазолина, разведенного до концентрации 12С были выявлены только покоящиеся формы. Активированных форм не обнаружено.

Во втором опыте, в качестве аллергена был использован, готовый раствор для инъекций цефазолина. И при сохранении идентичности методологии проведения эксперимента, во второй пробе были обнаружены активные формы базофилов.

Выводы:

В результате проведенного исследования, были получены данные об отсутствии физиологического эффекта, от применения сверхмалых доз аллергена, на базофилы: в ходе анализа методом проточной цитометрии, в пробе с применением сверхмалых концентраций аллергена не было получено достоверных данных о наличии активных клеточных форм.

Исследование было выполнено в полном объеме. Достигнута и цель исследование – изучение физиологического эффекта сверхмалых доз вещества. Но, не смотря на это, не выясненным остается непосредственный механизм воздействия и клинического эффекта от гомеопатических препаратов.

В связи с этим, необходимо осторожно применять гомеопатические препараты при острых, хронических и других патологических состояниях. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предостерегает от гомеопатического лечения инфекционных и любых других серьёзных заболеваний. По мнению экспертов организации, «использование гомеопатии не имеет доказательной базы, а в тех случаях, когда применяется в качестве альтернативы основному лечению, оно несёт реальную угрозу здоровью и жизни…»

 

 

 

Вернуться к списку