Бобровский М.А. – ветеринарный врач терапевтического отделения ИВЦ МВА
Резюме
На фоне развития технологий получения холодной плазмы, все больший интерес представляет применение данных технологий в ветеринарной медицине и хирургии в частности. Холодная неравновесная плазма атмосферного давления имеет ряд специфических, физических свойств оказывающих выраженный бактерицидный и биостимулирующий эффект. Эти свойства можно успешно использовать для контроля течения раневого процесса у животных. Данная работа посвящена исследованию бактерицидных свойств холодной неравновесной плазмы атмосферного давления в эксперименте In vitro.
Сокращения
САР (cold atmospheric plasma) - холодная плазма атмосферного давления. МПА - мясопептонный агар. УФ - ультрафиолетовое излучение.
Введение
В последнее десятилетие, активными темпами развиваются технологии получения низкотемпературной плазмы. Начавшееся освоение методик применения холодной плазмы в технике и промышленном производстве, быстро перетекло в новую, инновационную сферу медицины. Холодная плазма атмосферного давления (САР) имеет широкий потенциал воздействия на живые клетки и ткани, проявляющийся в физическом уничтожении микроорганизмов и непосредственной стимуляции процессов регенерации ран. Учитывая безболезненность процесса взаимодействия САР с тканями животных, данная методика открывает новые возможности лечения ран и контроля раневого процесса [3].
Плазма - ионизированный квазинейтральный газ, содержащий свободные электроны, положительно и отрицательно заряженные ионы. На сегодняшний день установлено, что большая часть вещества во вселенной, находится в состоянии плазмы [1].
В самом простом понимании, плазму принято делить на низкотемпературную (106<К) и высокотемпературную (>106К), а также на равновесную и неравновесную. В неравновесной плазме электронная температура значительно превышает суммарную температуру ионов. В равновесной плазме суммарные значения обеих температур примерно равны, при этом равновесная плазма зачастую является горячей (>106К) [5].
Низкотемпературная плазма называется равновесной, если её компоненты находятся в термодинамическом равновесии, т.е. температура электронов, ионов и нейтральных частиц совпадает. В низкотемпературной плазме легко создаются неравновесные условия в результате селективного действия внешних электрических полей: электрическая энергия от них передается заряженным частицам, а те отдают её частицам газа при столкновениях. При таком способе введения энергии средняя энергия заряженных частиц может значительно отличаться от тепловой энергии нейтральных частиц. В первую очередь это относится к электронам, которые из-за малой массы неэффективно обмениваются энергией при упругом столкновении с нейтральными частицами газа. При этом не только средняя энергия электронов, но и вид распределения электронов по энергиям может существенно отличаться от равновесного [5].
Исходя из того, что основным механизмом в равновесной плазме является тепловое сжигание, требующее высокой температуры рабочего газа, широкого применения в медицине, в отличии от неравновесной, она не находит.
Цель исследования
Изучить бактерицидное действие низкотемпературной, неравновесной гелиевой плазмы атмосферного давления на наиболее патогенные культуры возбудителей раневой инфекции животных, in vitro. Установить оптимальные режимы экспозиции обработки.
Материалы и метод
Для проведения исследования, нами были подготовлены разведения музейных штаммов патогенных культур E.coli, St.aureus и Ps.aeruginosa, в разведении 1:100000000, в соответствии с установленным оптическим стандартом мутности (Рис.1). Посев культуры осуществлялся на мясопептонный агар, разлитый в стандартные чаши Петри, разделенные на три части. Засеваемая площадь МПА составила 1см2.
Таким образом подготовлено 5 образцов для обработки в течение 1, 2, 3, 4 и 5 мин (образцы № 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно), а также контрольная чаша. Обработка засеянных культур осуществлялась факелом плазменного потока гелия марки “Б”, сгенерированного аппаратом “Гелиос”, с расстояния 1 см (Рис. 2, 3). После обработки в течение соответствующего времени, образцы помещались в термостат при температуре 35 оС, на 24 часа. После экспозиции проб в термостате, осуществлялась качественная оценка роста колоний на поверхности МПА. Отсутствие роста колоний подтверждалось повторным пересевом отрицательных проб на МПА.
Рис.1 Подготовка образцов E.coli, St.aureus и Ps.aeruginosa к посеву на МПА.
Результаты и обсуждения
Бактерицидное действие САР является комплексным и обусловлено проявлением целого ряда химических и физических эффектов. Поток неравновесной плазмы, является источником теплового излучения, однако данное явление не может считаться значимым в проявляемых бактерицидных эффектах т.к. температура неравновесной плазмы, генерируемой большинством источников, не превышает 36-40°С [8].
Другим более важным компонентом плазменного факела, является УФ излучение. УФ излучение с длиной волны менее 300 нм, оказывает выраженный бактерицидный эффект за счет активации образования тиминовых димеров. УФ излучение обладает хорошей проникающей способностью и способно разрушать межмолекулярные связи некоторых соединений, приводя к накоплению цитотоксических веществ. Однако интенсивность излучения факела - величина непостоянная, зависящая от типа аппарата, характера разряда и вида газовой смеси. К тому же доля активного спектра, в общем спектре излучаемого ультрафиолета, не достаточно значительна чтобы оказать значимый бактерицидный эффект [4,7].
Куда более значимыми являются эффекты, оказываемые потоком заряженных частиц - ионов и электронов. В активном центре факела, рождаются активные формы атмосферного азота и кислорода (Рис. 4), проникающие в бактериальную клетку и индуцирующие процессы накопления свободных радикалов, окислительного повреждения мембранных органелл и органических соединений (липиды, полисахариды, РНК, ДНК и т.д.). А поток свободных электронов, помимо прямого эффекта ионизации, проявляет синергизм действия с другими заряженными частицами - осевшие заряженные частицы вызывают накопление на поверхности мембраны заряда, который способен влиять на проницаемость микробной стенки, а также вызывать разрыв мембран за счет электростатических сил [2].
Рис. 4 Реакции образования активных форм кислорода и азота.
В ходе оценки данных роста колоний E.coli, St.aureus и Ps.aeruginosa на МПА, выявлен активный рост контрольного образца (Рис. 5); наличие незначительного, макроскопически видимого роста колоний Ps.aeruginosa в образце №1 (Рис. 6); отсутствие роста колоний в образцах под номерами 2, 3, 4 и 5, соответствующим времени экспозиции 2, 3, 4 и 5 мин (Рис. 7). Пересев культур E.coli и St.aureus из области посева образца №1, роста соответствующих колоний не выявил. Пересев образцов № 2, 3, 4 и 5 - также не выявил роста колоний соответствующих культур.
Рис.4 Контрольный образец. Наблюдается выраженный рост культур E.coli, St.aureus и Ps.aeruginosa.
Рис. 5 Наличие роста колоний Ps.aeruginosa в образце №1.
Рис. 6 Отсутствие роста колоний в образцах № 2, 3, 4 и 5. На фотографии, буквам А, Б, В и Г соответствуют образцы 2, 3, 4 и 5.
На основании полученных данных, нами установлено выраженное бактерицидное действие САР in vitro. Минимальное рекомендуемое время экспозиции обработки для достижения бактерицидного эффекта холодной неравновесной гелиевой плазмы атмосферного давления, при соблюдении аналогичных условий, составило 2 мин. Полученные данные, подтверждаются двукратным повторением эксперимента, с сохранением первоначальных условий.
Список литературы
1. Fridman G., Friedman G., Gutsol A., Shekhter A.B., Vasilets V.N., Fridman A. Applied Plasma Medicine // Plasma Process. and Polym. – 2008. – V. 5. – Iss. 6. – P. 503–533. 2. Gaunt L.F., Beggs C.B., Georghiou G.E. Bactericidal Action of the Reactive Species Produced by Gas-Discharge Nonthermal Plasma at Atmospheric Pressure // IEEE Transactions on Plasma Science. – 2006. – V. 34. – № 4. – P. 785–801. 3. Heinli J., Isbar, G., Stolz W., et al. // Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 2011. V. 25. P. 1. 4. Sohbatzadeh F., Hossienzadeh Colagar A., Mirzanejhad S., et al. // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2010. V. 160. P. 1978. 5. Yang L., Chen J., and Gao J. // Journal of Electrostatics. 2009. V. 67. P. 646 6. Tandara A.A., Mustoe T.A. Oxygen in wound healing – more than a nutrient // World J. Surg. – 2004. – V. 28. – P. 294–301. 7. Heinlin J, Zimmermann JL, Zeman F, Bunk W, Isbary G, et al. (2013) Randomized placebo-controlled human pilot study of cold atmospheric argon plasma on skin graft donor sites. Wound Repair and Regeneration (accepted for publication). 8. Isbary G, Heinlin J, Shimizu T, Zimmermann JL, Morfill G, et al. (2012) Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol 167: 404-410.